Mikromalowanki biologów, czyli w pracowni histologa

Normalni, przeciętni ludzie malują jajka, na Wielkanoc. Artyści malują obrazy, grafficiarze ściany a biolodzy? Biolodzy malują komórki i tkanki. Czy to jakaś wyrafinowana technika plastyczna? Biolodzy, wybarwiają tkanki, komórki lub fragmenty komórek, aby uwidocznić różne struktury i aby lepiej widzieć obiekty przyrodnicze. Barwią więc z ciekawości poznawczej. Następnie efekty swoich poczynań oglądają pod mikroskopem. Nierzadko tak wykonane preparaty są po prostu piękne (zobacz fotografie niżej), niezależnie od tego, co tam przedstawiają.

Przykładowe techniki stosowane w Katedrze Anatomii Porównawczej: barwienie metodą immunofluorescencji, barwienie immunoenzymatyczne, barwienie histologiczne metodą Nissla, impregnacja azotanem srebra wg metody Golgiego. Brzmi zbyt skomplikowanie? Przyjdź zatem na Wydział Biologii w czasie Nocy Biologów (13 stycznia 2012) to naukowcy wyjaśnią ci dokładnie a nawet zademonstrują. Ba, samodzielnie można będzie wykonać różnorodne preparaty.

Barwienie metodą immunofluorescencji. Immunofluorescencja jest jedną z dziedzin histochemii, a dokładniej jest zbiorem metod pozwalających na umiejscowienie w komórkach lub tkankach określonych substancji z wykorzystaniem przeciwciał. Inaczej mówiąc to połączenie metod histologicznych z reakcjami immunologicznymi. Cechuje je specyficzność, a ich wynikiem jest umiejscowienie specyficznych substancji, których poszukujemy. W metodzie tej dochodzi do oddziaływania pomiędzy substancją, którą wprowadzamy i substancją, której poszukujemy w preparacie. Wykorzystuje ona znakowane fluorochromami (substancje, które wykazują zdolność do emitowania światła po pobudzeniu ich źródłem promieniowania) przeciwciała w celu lokalizacji antygenów (substancji poszukiwanych).

Tkankę przeznaczoną do barwień immunofluorescencyjnych, utrwaloną perfuzyjnie dotrwala się dodatkowo immersyjnie w płynie perfuzyjnym przez okres 2-3 godzin, a następnie płucze w buforze fosforanowym (0,1 M, pH 7,2-7,4) przez okres 3 dni. Tak przygotowany materiał poddawany jest następnie kąpieli w 19 % i 30 % roztworach sacharozy przez okres od 1 do 3 dni. Procedura ta ma typowe właściwości krioprotekcyjne, gdyż chroni materiał przed tworzeniem się dużych i działających destrukcyjnie kryształów lodu powstających samoistnie w procesie zamrażania tkanki. Po przepojeniu tkanek sacharozą, i ich zatonięciu, bloki tkanki zamraża się przy pomocy kriostatu lub ciekłego azotu. Etap ten pozwala na zachowanie aktywności enzymów, konformacji przestrzennej peptydów i białek oraz zatrzymuje procesy autolizy. Zamrożone bloki tkankowe skroi się przy użyciu mikrotomu mrożeniowego na seryjne skrawki o grubości 10-20 µm w temperaturze -30oC. Skrawki przyklejane są na wcześniej przygotowane szkiełka podstawowe, które poddano kąpieli w roztworze chromalum.

Tak przygotowane preparaty poddawane są rutynowym barwieniom immunofluorescencyjnym. Barwienie takie każdorazowo przeprowadza się w komorze wilgotnej bez dostępu światła i składa się ono z kolejno następujących po sobie etapów.

W pierwszym etapie, skrawki rozmraża się w temperaturze pokojowej (ok. 30 minut), po czym każdy z nich obrysowuje markerem, który zapobiega rozlewaniu się nanoszonych substancji i ich mieszaniu się pomiędzy sobą. Tak przygotowane preparaty przenoszone są do komór wilgotnych, w których przebiega właściwy proces barwienia. Tu każdy skrawek płukany jest trzykrotne po 15 minut w buforze fosforanowym (PBS), a następnie poddawany 1 godzinnej inkubacji w roztworze blokującym (PAV). Etap ten jest niezbędny, gdyż doprowadza on do zablokowania wiązań nieswoistych w badanej tkance. Roztwór blokujący to zazwyczaj mieszanina następujących substancji: PBS, 10% roztwór surowicy koziej, 0,1 % BSA, 0,05 % roztwór thimerazolu, 0,01 % roztwór azydku sodu, tryton X-100. Po inkubacji w roztworze blokującym skrawki ponownie trzykrotnie płukane są po 15 minut w roztworze PBS, po czym nasyca się je roztworem przeciwciał pierwotnych. Okres inkubacji w roztworze przeciwciał pierwotnych wynosi zazwyczaj ok. 14 -16 godzin. Dnia następnego, po wypłukaniu w roztworze PBS (3 razy po 15 minut) skrawki przepajane są roztworem przeciwciał wtórnych, znakowanych fluorochromem. Okres inkubacji w tym wypadku wynosi zazwyczaj 1 godzinę. Tak wybarwione skrawki po trzykrotnym płukaniu w roztworze PBS pokrywane są roztworem glicerolu i zamykano pod szkiełkiem nakrywkowym.

Barwienie immunoenzymatyczne. W metodach tych sposób przygotowania tkanki i proces barwienia jest bardzo podobny jak w przypadku fluorescencji. Zasadnicza różnica polega na tym że przeciwciała znakowane są enzymami. Ostatecznie wizualizuje się je specjalnymi chromogenami (substrat dla enzymu który po reakcji enzymem daje barwny produkt).

Barwienie histologiczne metodą Nissla. Technika Nissla pozwala na wizualizację substancji tigroidowej w neuronach, a tym samym doskonale charakteryzuje ich perikariony (ukazuje granice przestrzenne ciała komórki, jądro i jąderko). Metoda ta nie pozwala jednak na wizualizację, a tym samym obserwację i analizę wypustów neuronalnych tj. dendrytów i aksonów.
Mózgowia przeznaczone do barwień metodą Nissla poddawane są procesowi postfiksacji na drodze immersyjnego dotrwalania w 4% roztworze zobojętnionej formaliny przez okres nie krótszy niż 3 miesiące. Tak utrwalony materiał poddany zostaje płukaniu w bieżącej wodzie przez 24 godziny. Kolejnym etapem jest dehydratacja tkanki. W tym celu opłukany eksplantat odwadnia się, używając ciągu alkoholu etylowego o wzrastającym stężeniu (50%, 70%, 96%, oraz alkoholu absolutnego 99,8%). Odwodnione tkanki prześwietla się za pomocą ksylenu i zatapia w parafinie, formując bloczki. Bloczki parafinowe krojone są seryjnie przy pomocy mikrotomu saneczkowego na skrawki o grubości 10-50 µm, które jednocześnie następnie naklejane są na wcześniej spreparowane podstawowe szkiełka mikroskopowe. Tak uzyskane preparaty poddawane są barwieniu fioletem krezolowym według metody Nissla, wykorzystując dwa szeregi naczyń laboratoryjnych. W pierwszym szeregu skrawki są odparafinowywane, po czym uwodnia się je w alkoholach o malejący stężeniu i nasyca roztworem barwnika (ksylen I, ksylen II, 99,8%, 96%, 80%, 70%, 50%, H2O, fiolet krezolowy). W drugim szeregu skrawki płukane są w wodzie z dodatkiem kilku kropli kwasu octowego, różnicowane w 96% alkoholu, odwodniane w alkoholu 99,8% i prześwietlane w ksylenie (H2O, kwas octowy, 96%, 99,8%, ksylen I, ksylen II). Po prześwietleniu preparaty zamykane są w balsamie kanadyjskim.

Impregnacja azotanem srebra wg metody Golgiego. W tym celu umieszcza się je na tydzień w 2,5% roztworze dwuchromianu potasu, a na kolejny tydzień w 2,5% roztworze azotanu srebra. Po czym przeprowadza się je przez szereg alkoholowy i zatapia w parafinie, Bloczek parafinowy kroi się na mikrotomie. Uzyskane skrawki naklejane są na szkiełka podstawowe i zamykane w balsamie kanadyjskim. Metoda impregnacji srebrowej doskonale uzupełnia poprzednią metodę, ukazując dokładny wygląd, ilość i długość wypustek neuronu, nie daje jednak obrazu jego wnętrza.

KAP/S.C.