piątek, 6 października 2017

Badania proteomiczne roślin w Europie

Rośliny, jak wszystkie inne organizmy żywe, aby mogły wykonywać funkcje życiowe potrzebują białek. Białka to funkcjonalne cząsteczki, które napędzają szlaki metaboliczne i regulacyjne w komórce. Nazwa białko pochodzi z języka greckiego („prota”), co oznacza „podstawowe znaczenie”. Badaniem białek zajmuje się proteomika. Badania dotyczą ich struktury, sprawowanych przez nie funkcji i zależności między nimi. Proteomika obejmuje jednoczesną globalną analizę mieszanin tysięcy białek w systemach biologicznych, w pewnym punkcie czasowym. Ma ona na celu zidentyfikowanie wszystkich obecnych białek i scharakteryzowanie ich zmian ilościowych i jakościowych, na przykład w odpowiedzi na zmiany środowiskowe. Termin proteomika po raz pierwszy został użyty w 1995 roku. Nazwa proteom jest skrótem pochodzącym od: PROTEin component of the genOME, co w uproszczeniu można przetłumaczyć jako komponenta białkowa kodowana przez genom. Właśnie proteom i jego zmiany są obiektem zainteresowania proteomiki. Proteomika jest cennym uzupełnieniem badań genomowych i transkryptomicznych oraz pojawiających się nowych dziedzin nauki. Chociaż protokoły zostały opracowane w celu przeprowadzenia analizy proteomicznej w ludzkich, zwierzęcych i mikrobiologicznych organizmach, królestwo roślin oczekuje systematycznego podejścia do analizy proteomu.

Aktualnie stosowane są trzy różne strategie proteomiczne. Każda z nich ma swoje zalety i wady oraz wymaga innego zestawu aparatury. Najpopularniejsza jest strategia „bottom–up”, polegająca na rozdziale mieszaniny białek za pomocą elektroforezy dwukierunkowej. W metodzie tej analizuje się peptydy uzyskane w wyniku enzymatycznego trawienia białka. Sekwencje peptydowe, które otrzymuje się metodą spektrometrii mas, są podstawą identyfikacji białek. Kolejną strategią jest technika „shotgun”, oparta na wstępnym trawieniu wszystkich białek i rozdziale mieszaniny peptydów metodą wielowymiarowej chromatografii cieczowej, w połączeniu z identyfikacją za pomocą spektrometrii mas. W metodzie tej omija się czasochłonne rozdziały z użyciem 2-D PAGE, lecz technika ta nie pozwala na identyfikację izoform białek. W ostatnich latach rozwój technik fragmentacji dużych cząsteczek umożliwiał wprowadzenie metody „top-down”, polegającej na fragmentacji całych białek, bez konieczności ich trawienia. W metodzie tej analizuje się białka natywne, bez ich uprzedniej proteolizy. Zaletą tej metody jest identyfikacja modyfikacji potranslacyjnych.

Rośliny wykazują wysokie zróżnicowanie na poziomie biochemicznym, komórkowym i całego organizmu, w celu przetrwania zagrożeń ekologicznych. Wytwarzanie metabolitów, indukcja mechanizmów i kontrola rozwoju są napędzane przez białka. W związku z tym, że dotyczy to „głównych aktorów” w komórce, wybór analizy proteomu i wnikliwe zbadanie mechanizmów biorących udział w reakcji roślin na różne efektory, jest dobrym wyborem.

Szybki rozwój badań nad białkami doprowadził do odpowiedzi na różne pytania biologiczne. Niemniej jednak, proteomika nadal ma poważne ograniczenia, np. nie pozwala na separację i wizualizację kompletnego zestawu syntetyzowanych białek. Oszacowano, że obserwowana może być tylko mniej niż połowa przewidywanych białek Arabidopsis thaliana. Ponadto, techniki proteomiki stosowane w tkankach roślinnych mają wiele dodatkowych ograniczeń. Poza klasycznymi substancjami przeszkadzającymi podczas ekstrakcji białek (np. lipidy, kwasy nukleinowe, węglowodany), wydajne izolowanie białek roślinnych wymaga również usunięcia proteaz, polifenoli, tanin, pigmentów, ligniny i wosków. W przeciwieństwie do zwierząt, każda komórka roślinna jest dodatkowo otoczona przez ścianę komórkową, komplikującą ekstrakcję. Organy komórek roślinnych (mitochondria, chloroplasty itd.) mają, wraz z cytoplazmą, wyraźną funkcję metaboliczną, a więc zawierają unikatowy proteom, wymagający wstępnego frakcjonowania. Natomiast w organellach, takich jak chloroplasty, należy rozważyć podfrakcje w celu analizy białek stromy, tylakoidów i różnych błon. W zielonych tkankach duża ilość karboksylazy/oksygenazy rybulozo-1,5-bisfosforanu (RuBisCO – w liściach roślin stanowi ok. 50% wszystkich rozpuszczalnych białek) może zakłócić obrazy elektroforetyczne 2D. Obfitość tych białek powoduje znaczne problemy w wykryciu białek występujących w tkankach w małych ilościach. W nasionach występują analogiczne problemy z dużą ilością białek zapasowych. Identyfikacja białek roślinnych jest również trudniejsza niż w przypadku ludzi, drobnoustrojów czy zwierząt, ponieważ liczba sekwencjonowanych genomów, a zatem opisywanych białek jest względnie niska.

Obecnie wiele europejskich laboratoriów zaangażowanych jest w proteomikę roślin modelowych (tj. Arabidopsis thaliana, Medicago truncatula), w gatunkach roślin uprawnych lub roślin leśnych. Opracowują one specyficzne techniki ekstrakcji białek z różnych tkanek lub organelli. W innych laboratoriach podejmowane są wysiłki zmierzające do opracowania ilościowych metod wykrywania zmian w syntezie białek. Niektóre pracują nad bardziej efektywnymi metodami identyfikacji białek lub PTMs (modyfikacji potranslacyjnych). Wreszcie niektóre z nich koncentrują się na badaniach procesów fizjologicznych roślin, związków roślin ze środowiskiem naturalnym, syntezie bioproduktu roślinnego w celu uzyskania lepszej jakości żywności, paszy lub drewna. Należy jednak podkreślić, że w największym stopniu na rozwój nowych technik w badaniach proteomu wpływają kliniczne i farmaceutyczne grupy badawcze, wspierane przez bogate firmy.

W naszej części świata wzbogacanie wiedzy z zakresu proteomiki roślin w dużym stopniu odbywa się przez zintegrowaną sieć europejskich naukowców. Opracowaniem i udostępnianiem narzędzi do analizy proteomu w podstawowych i stosowanych obszarach badań roślinnych, mających na celu generowanie podstawowych informacji o metabolizmie roślin, badaniu odpowiedzi na ograniczenia środowiskowe i ocenie jakości żywności, w dużym stopniu zajmują się europejskie programy COST, w których od wielu lat uczestniczą pracownicy Katedry Biochemii Wydziału Biologii i Biotechnologii UWM. Warto wyróżnić tutaj ostatnie prace proteomiczne dr Angeliki Król, które pozwalają na lepsze zrozumienie procesów dotyczących odporności roślin na stresy abiotyczne oraz wyznaczenie markerów przydatnych w selekcji i uzyskanie bardziej odpornych odmian, lepiej przygotowanych do zmieniających się warunków klimatycznych. Na zdjęciu uczestnicy tegorocznego spotkania akcji COST w Oeiras (Portugalia).

Stanisław Weidner

Brak komentarzy:

Prześlij komentarz