Mikromacierze - przyszłość medycyny?

W ostatnich dekadach na rozwój medycyny, silny wpływ wywierają nauki biologiczne, a w szczególności biologia molekularna. Szereg technik stosowanych początkowo wyłącznie w badaniach podstawowych obecnie praktycznie zrewolucjonizowało diagnostykę medyczną. Po przełomie spowodowanym przez metody ELISA oraz PCR, w biologii molekularnej jaki w medycynie, kamieniem milowym można uznać poznanie pełnej sekwencji genomu ludzkiego. W konsekwencji nastąpił rozwój różnego typu technologii mikromacierzowych, które w krótkim czasie stały się jednym z głównych narzędzi służących zarówno do badania struktury genomów, jaki mechanizmów decydujących o sposobie ich funkcjonowania. Już wkrótce technologie mikromacierzowe, jak się wydaje, znajdą zastosowanie także w medycynie praktycznej. Analiza oparta na mikromacierzach ekspresyjnych umożliwia, bowiem diagnozę jeszcze przed pojawieniem się wyraźnych symptomów, precyzyjną ocenę stopnia zaawansowania choroby. A przede wszystkim prognozowanie dalszego rozwoju choroby, doboru optymalnej terapii oraz monitorowanie odpowiedzi na terapię i badanie metabolizmu leków. Żadna ze stosowanych dotąd metod diagnostycznych nie dostarcza tak wielkiej ilości informacji, trudno dziwić się, zatem, że podjęto szereg kroków zmierzających do praktycznego wykorzystania mikromacierzy ekspresyjnych.

Każda komórka czy tkanka wyróżnia się charakterystycznym dla niej profilem ekspresji genów. Markerem różnicującym stan chorobowy od fizjologicznego może być obecność albo brak określonego transkryptu (zmiana jakościowa), ale bardzo często jest to jedynie zmiana ilościowa, wyrażona w postaci kilkukrotnej różnicy w ilości danego mRNA. Już w 1999 r. Golub i wsp. wykazali, że profil ekspresji wybranych genów, wyznaczony za pomocą mikromacierzy oligonukleotydowych (chipów Affymetrix), może służyć, jako klasyfikator ostrych białaczek – szpikowej i limfoblastycznej. Niewiele później Alizadeh i wsp. posłużyli się podobną metodą (macierze cDNA) do klasyfikacji chłoniaka. Opracowane przez nich narzędzie, tzw. Lymphochip, umożliwiło precyzyjne rozróżnienie dwóch podtypów chłoniaka, wywodzących się z odrębnych linii komórek i cechujących się odmienną reakcją na chemioterapię. Oprócz białaczek i chłoniaków badaniami z zastosowaniem mikromacierzy ekspresyjnych objęto wiele innych chorób nowotworowych. Macierze DNA umożliwiły identyfikację genów – kandydatów na markery diagnostyczne m. in. raka: jajnika, piersi, prostaty, okrężnicy i płuc. Porównując profile ekspresji genów w różnych gruczolakorakach (płuc, piersi, prostaty, odbytu, macicy, jajników), zarówno pierwotnych jak i wtórnych, wyodrębniono sygnaturę ekspresji genów typową dla przerzutów guzów litych i złej prognozy. Dowiedziono też, że jednym z genów podlegających represji w gruczolakorakach jest czynnik transkrypcyjny RUNX1, znany supresor nowotworów. Borczuk i wsp. wykorzystali chipy Affymetrix do identyfikacji genów markerowych raka płuc w próbkach uzyskanych od pacjentów metodą biopsji. Mimo że preparaty pobrane w ten sposób często zawierają domieszki komórek prawidłowych (płuc, mięśni, skóry, leukocytów) wykazano, że nie przeszkadza to w ich wykorzystaniu do celów diagnostycznych z zastosowaniem mikromacierzy DNA. Zidentyfikowano blisko sto genów, których ekspresja decyduje o przynależności do histologicznej klasy raka płuc, np. gruczolakoraka, raka drobnokomórkowego i raka płaskonabłonkowego. Wyłoniono również geny o potencjalnym znaczeniu prognostycznym. W badaniach nie drobnokomórkowego raka płuc określono profile ekspresji genów typowe dla histologicznych podtypów tej choroby, zidentyfikowano sygnatury genowe informujące o stadium choroby, prognozie, stopniu zróżnicowania nowotworu i możliwości wystąpienia przerzutów. Stwierdzono, że organ specyficzny gen LUNX, charakteryzujący się wysokim poziomem ekspresji w zdrowych płucach, a niewykrywalny w żadnej innej zdrowej tkance, może służyć, jako gen markerowy do wczesnej detekcji przerzutów. Zaobserwowano ponadto, że profil ekspresji genów w raku płuc u palaczy tytoniu znacząco różni się od profilu ekspresji genów w raku płuc u osób niepalących, co sugeruje udział odmiennych, zależnych od uwarunkowań środowiskowych, mechanizmów w patogenezie raka płuc.

Rak piersi, ze względu na powszechność występowania, jest jednym z najczęściej badanych nowotworów. Dotychczasowe metody klasyfikacji raka piersi nie są w stanie oddać klinicznej różnorodności tej choroby. Klasycznym już molekularnym markerem diagnostycznym jest ekspresja receptorów estrogenowych (ER). W badaniach mikromacierzowych wyróżniono pięć podtypów molekularnych raka piersi. W sposób powtarzalny w badaniach innych grup obserwuje się występowanie głównie dwóch podtypów. Jest to podtyp przewodowy (luminalny, ang. luminal A) i podtyp podstawny (bazalny, ang. basal-like). Pierwszy charakteryzuje się ekspresją genu receptora estrogenowego oraz markerów warstwy wewnętrznej nabłonka przewodów mlekowych, drugi zaś wykazuje brak ekspresji genu ER i obecność markerów warstwy podstawnej nabłonka. Podtyp luminalny charakteryzuje się lepszym rokowaniem niż podtyp bazalny. W licznych badaniach raka piersi zidentyfikowano także geny związane z prognozą i wykazano różnice w profilu ekspresji genów m. in. w nowotworach wywołanych mutacjami w genach BRCA1 i BRCA2. Na przykładzie raka piersi zademonstrowano również, że mikromacierze DNA mogą być pomocne w detekcji komórek nowotworowych, które uwalniane są do krwi pacjentów. Spośród 170 genów o zróżnicowanej ekspresji w nowotworach naciekających piersi wybrano 12 markerów molekularnych (o ok. 10-krotnie podwyższonej ekspresji), które można łatwo wykryć w prostym teście z próbki krwi (62). Niezwykle ważnym aspektem badań genomicznych raka piersi jest powiązanie wyników analizy ekspresji genów z terapią. W wielu przypadkach niskozaawansowanego raka piersi stosowanie uzupełniającej chemioterapii jest zbędne i przynosi organizmowi więcej szkody niż pożytku. Z kolei pewien odsetek przypadków, mimo niskiego zaawansowania i pozornie dobrego rokowania ma zwiększone ryzyko rozsiewu i wymaga agresywnej terapii. Są już na rynku usług medycznych testy mikromacierzowe, które na podstawie profilu ekspresji wybranych genów wspomagają rokowanie i pozwalają dobierać terapię w bardziej zindywidualizowany sposób. Test MammaPrint (70-genowa sygnatura prognostyczna) ma znaczenie wspomagające przy wprowadzaniu uzupełniającej chemioterapii u pacjentek poniżej 65 r.ż., z guzem T1-2 i bez przerzutów do węzłów chłonnych. Z kolei test OncotypeDX (21 genów) ma zastosowanie do pacjentek T1-2, N0, z guzami estrogenododatnimi, które są zakwalifikowane do uzupełniającego leczenia hormonalnego i chemioterapii. Na podstawie wskazań testu niektóre pacjentki mogą uniknąć niepotrzebnego w ich przypadku podawania cytostatyków. Nie ulega wątpliwości, że rozwój technologiczny obserwowany w ostatnich latach diametralnie zmienił oblicze diagnostyki medycznej. W zakrojonych na szeroką skalę badaniach genomicznych wykazano z jednej strony istnienie generalnych mechanizmów rozwoju chorób, a z drugiej podkreślono znaczenie zmienności osobniczej dla przebiegu i leczenia tych chorób.

Wprowadzenie mikromacierzy DNA do diagnostyki klinicznej, którego jesteśmy świadkami, jest pierwszym krokiem w kierunku medycyny personalizowanej. Z każdym dniem publikowane są coraz to nowsze wyniki badań z wykorzystaniem tej techniki i miejmy nadzieję, że w niedalekiej przyszłości tego typu badania staną się standardem w polskich szpitalach.

Karol Szeszko 

Źródła:

• Żmieńko A., Guzowska-Nowowiejska M., Pląder W., Figlerowicz M., „Analiza aktywności transkrypcyjnej genomu przy zastosowaniu mikromacierzy dachówkowych”, 2008, Biotechnologia 4(83), 101–114; 
• Golub T. R., Slonim D. K., Tamayo P., Huard C., Gaasenbeek M., Mesirov J. P., et al. “Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring”, 1999, Science, 286, 531-537. 
• Möröy T., “DNA Microarrays in Medicine: Can the Promises Be Kept?” 2002 Journal Biomedical Biotechnology 2(1), 1–2; 
• Alizadeh A. A., Eisen M. B., Davis R. E., Ma C., Lossos I. S., Rosenwald A., Boldrick J. C., et al., “Microarrays in Disease Diagnosis and Prognosis”, 2000, Nature, 403, 503-511; 
• Borczuk A. C., Shah L., Pearson G. D., Walter K. L., Wang L., Austin J. H., Friedman R. A., Powell C. A., “Molecular Signatures in Biopsy Specimensof Lung Cancer”, 2004, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 170(2), 167-174. 
• Petty R. D., Nicolson M. C., Kerr K. M., Collie-Duguid E., Murray G. I., “Gene Expression Profiling in Non-Small Cell Lung Cancer From Molecular Mechanisms to Clinical Application”, 2004, Clin. Cancer Res., 10, 3237-3248. 
• Sorlie T., Tibshirani R., Parker J., Hastie T., Marron J. S., Nobel A., Deng S., et al., “Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets.” 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 8418-8423